一、支原體檢測試劑盒的產(chǎn)品特色：  

（1）僅需1μl培養(yǎng)細胞上清液和1臺水浴鍋，不需要提取基因組DNA，不需要熒光顯微鏡、PCR儀、電泳儀、凝膠成像儀、生物發(fā)光檢測儀等復(fù)雜實驗設(shè)備；  

（2）僅需1h出結(jié)果，簡單快速靈敏的細胞支原體檢測方法；  

（3）僅需一步操作完成整個實驗，實驗結(jié)果根據(jù)反應(yīng)液顏色變化肉眼直觀容易辨別，無需電泳，避免多步操作開蓋帶來的假陽性風(fēng)險；  

（4）靈敏度遠遠高于PCR法，能夠檢測細胞培養(yǎng)中常見的多種支原體（豬鼻支原體、jing氨酸支原體、口腔支原體、萊氏無膽甾原體、發(fā)酵支原體、唾液支原體、人型支原體、梨支原體，占支原體污染的98%）。  

二、支原體檢測試劑盒組成（25T）：

三、實驗步驟：  

（1）待測細胞培養(yǎng)液上清準(zhǔn)備  

待測細胞在培養(yǎng)2-3天且融化度最好達到80%以上時取細胞培養(yǎng)液200μL以上體積，按照200g離心5分鐘，然后取上清液進行后續(xù)檢測（不要取到管底部50μl培養(yǎng)液及細胞沉淀即可）；  

（2）反應(yīng)體系配制（首先將溶液A、溶液B、陽性對照、石蠟油解凍融化后立即放置于冰上）  

將溶液A從-20℃取出，待其解凍融化后，上下輕輕顛倒混勻。根據(jù)待測細胞樣本數(shù)量在微量離心管中配制如下反應(yīng)體系（反應(yīng)體系配制過程在冰上進行非常重要）；

備注：每次實驗需要1個陰性對照、1個陽性對照及由于移液器存在移液誤差，所以檢測N個樣品一般推薦配制N+3個上述反應(yīng)體系  

用震蕩器輕輕混勻，然后分裝到PCR管中（推薦使用200μl體積PCR管），每管分裝24μl上述混勻后的反應(yīng)液；  

（3）上樣（整個上樣過程保持冰上進行非常重要，特別是反應(yīng)液上方覆蓋的石蠟油需要冰上預(yù)冷）  

待測樣品：向反應(yīng)管中加入1μl待測離心后培養(yǎng)液上清，然后用此加液槍上下移動輕輕吹打5次；  

陰性對照：不加入任何樣品或加入1μl無菌水；  

陽性對照：加入1μl陽性對照樣品，然后用此加液槍上下移動輕輕吹打5次；  

然后每反應(yīng)管溶液上方輕輕中加入25μl石蠟油（水浴鍋中進行反應(yīng)），以防止液體蒸發(fā)導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確。加入石蠟油時請注意每次更換槍頭，防止樣品之間交叉污染。如果反應(yīng)是在PCR儀中進行反應(yīng)，不需要加入石蠟油。  

（4）反應(yīng)  

將水浴鍋或PCR儀溫度設(shè)置成61℃，放入反應(yīng)管，孵育60min；  

備注:  

1、水浴鍋實際溫度可能與設(shè)置溫度有所偏差，建議先用溫度計進行校準(zhǔn)。實際上59-63℃反應(yīng)都可以進行，但會影響檢測靈敏度；  

2、反應(yīng)產(chǎn)物不可開蓋，否則產(chǎn)生的氣溶膠會導(dǎo)致后續(xù)檢測假陽性的出現(xiàn)。建議將反應(yīng)管包扎在塑料袋或手套中,丟棄到專用垃圾桶中,并及時清理；  

3、不建議使用烘箱或金屬浴進行加熱反應(yīng)；  

（5）結(jié)果判斷  

61℃反應(yīng)60min后，立刻取出反應(yīng)管，放于室溫。在光線良好的環(huán)境中觀察反應(yīng)結(jié)果（建議以白紙為背景）。如果反應(yīng)液仍為藍紫色，則判定為陰性；若反應(yīng)液為天藍色，則判定為陽性。

四、相關(guān)文獻  

1、ShiyuHe,YanzhiHuang,YanlingZhao.AReverseTranscription-PolymeraseSpiralReaction(RT-PSR)-BasedRapidCoxsackievirusA16DetectionMethodandItsApplicationintheClinicalDiagnosisofHand,Foot,andMouthDisease.FrontiersinMicrobiology.2020;12(11):734-743.  

2、AudreyJean,FlorenceTardy,OmranAllatif.AssessingmycoplasmacontaminationofcellculturesbyqPCRusingasetofuniversalprimerpairstargetinga1.5kbfragmentof16SrRNAgenes.PLOSONE.2017;12(2):e0172358.  

3、ZohreSoheily,MohammadSoleimani,KeivanMajidzadeh-Ardebili.DetectionofMycoplasmaContaminationofCellCulturebyALoop-MediatedIsothermalAmplifcationMethod.CellJ.2019;21(1):43-48.  

4、XinXu,XueyuWang,WenHu.AnImprovedPolymeraseCross-LinkingSpiralReactionAssayforRapidDiagnosticofCanineParvovirus2Infection.FrontiersinVeterinaryScience.2020;7(57):1629-1636.